JM110超級感受態細胞,英文名JM110 Super Competent Cells,是一種可以用于常規質粒高效轉化的未甲基化質粒克隆用E. coli JM110即用型化學感受態細胞。使用pUC19質粒進行熱激活轉化,在嚴格按照使用說明進行操作時,轉化效率可以達到1.0±0.5×107cfu/μg DNA。
JM110菌株由于甲基化酶基因Dam和Dcm的缺失,使得在該宿主菌中擴增的質粒DNA或噬菌體DNA(phagemid DNA)沒有發生相應的甲基化修飾,因而能被某些對相應甲基化修飾敏感的限制性內切酶酶切。Dam甲基化酶識別DNA序列GATC上的腺嘌呤殘基并使其N-6位點上發生甲基化,而Dcm甲基化酶識別DNA序列CCAGG和CCTGG上的胞嘧啶殘基并使其C-5位點上發生甲基化;JM110菌株具有硫酸鏈霉素抗性(StrR)。lacIqlacZΔM15的存在使JM110可以進行藍白斑篩選,但轉化效率不高,一般不用于質粒構建,只適用于質粒轉化。
缺失dam基因可能會引起細胞突變,請在轉化后24小時內挑取克隆,避免挑取直徑顯著大于其他的克隆。
JM110菌株的基因型為rpsL (StrR) thr leu thi-1 lacY galK galT ara tonA tsx dam dcm supE44Δ(lac-proAB) /F[traD36 proAB lacIqlacZΔM15]。
保存條件:
-80ºC保存,一年內有效。避免反復凍融,通常制備6個月后轉化效率隨保存時間延長而逐漸降低。
注意事項:
感受態細胞禁止反復凍融,并應盡可能避免凍融,反復凍融會導致轉化效率大幅下降。
感受態細胞融化后,須盡快加入待轉化樣品,不宜在無轉化產物的情況下放置時間超過10分鐘或以上時間,以免降低感受態細胞的轉化效率。
待轉化樣品的體積通常不宜超過感受態細胞體積的10%,樣品體積過大會導致轉化效率下降。
感受態細胞對于溫度變化非常敏感,需要避免出現不應有的使用說明之外的溫度變化。
感受態細胞對于機械力非常敏感。加入待轉化樣品時應輕柔操作,不能使用移液槍吹打混勻。
通常僅建議取部分樣品用于轉化,這樣萬一遇到轉化失敗的情況,還留有樣品可以再次進行轉化。
使用說明:
1.解凍感受態細胞。取感受態細胞放置冰浴或冰水浴中融化,通常需要5分鐘以上的時間。解凍后須盡量在10分鐘內使用,放置時間過長會影響轉化效率。
2.DNA樣品的轉化。取一管感受態細胞,加入DNA樣品,例如質粒、連接產物或重組產物等,輕輕彈擊管底約2-3次或輕輕晃動約2-3次以混勻,立即冰浴靜置30min。注意:所用DNA體積通常不宜超過感受態細胞體積的10%,混合時不得使用移液器進行吹打。如果用于質粒的轉化擴增,冰浴靜置約10分鐘,后續可以直接涂板并培養過夜;如果用于連接產物或重組產物的轉化,建議冰浴靜置30min并嚴格執行后續的熱激處理和復蘇培養等步驟,以提高轉化效率。
3.熱激處理。將冰浴放置的離心管快速置于42℃水浴中,靜置熱激45秒。隨后立即轉移至冰水浴中靜置2分鐘以快速冷卻至接近零度。熱激及轉移至冰浴過程中切勿晃動離心管。
4.復蘇培養。加入900μl不含抗生素的LB培養基,顛倒數次混勻,37℃搖床約150rpm復蘇培養1小時。如果用于質粒的轉化擴增,復蘇培養10-20分鐘也完全足夠了;如果用于連接產物或重組產物的轉化,建議嚴格進行復蘇培養操作。
5.收菌涂板。約5000g室溫離心1min,沉淀細菌,吸除約900-950μl上清,余下的約50-100μl上清。用移液器輕輕吹打并重懸菌體,隨后涂布到含相應抗生素的LB平板上。注意:如果用于質粒的轉化擴增,可以僅取少量進行涂板;如果用于連接產物或重組產物的轉化,建議取所有重懸的菌液涂板。
6.將平板倒置放于37℃培養箱培養過夜。
本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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